روش اندازه گیری میزان پرولین در گیاهان
اندازه گیری اسید آمینه پرولین
برای اندازهگیری پرولین از روش نین هیدرین اسید (Bates et al, 1973):
مواد لازم :
1. اسید سولفوسالسیلیک 3 درصد: 30 میلی لیتر اسید ← به حجم یک لیتر با آب مقطر
2. تهیه معرف نینهیدرین: نینهیدرین- اسید استیک گلاسیال- اسید فسفریک← 25/1 گرم نین هیدرین در 30 میلی لیتر اسید استیک و 20 میلی لیتر اسید فسفریک 6 مولار توام با گرم کردن
100 × 98 100× جرم مولکولی اسید
82/67 ═ ———— ═ ————————— ═ برای تهیه اسید فسفریک یک مولار به حجم یک لیتر
7/1 ×85 چگالی × درصد خلوص
برای تهیه اسید فسفریک 6 مولار به حجم یک لیتر 92/406 ═ 6× 82/67
3. تولوئن
4. پرولین خالص جهت تهیه استاندارد: برای تهیه استاندارد ppm 100، 100 میلی گرم پرولین خالص در یک لیتر آب مقطر حل کرده، سپس از محلول مادری ppm 100 استانداردهای1، 2، 5، 10، 20 را تهیه میکنیم.
روش کار :
ابتدا 5/0 گرم از هر نمونه گیاه را پس از خارج سا ختن از فریزر توزین شد و به آنها 10 میلیلیتر اسید سولفوسالسیلیک 3 درصد اضافه و در هاون چینی خوب سائیده و هموژنیزه شدند، سپس مخلوط حاصل در درون لوله آزمایش ریخته شده و 10 دقیقه با سرعت 2000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. 2 میلیلیتر از عصاره صاف شده برداشته شد و در یک لوله آزمایش ریخته شد . سپس به هر لوله 2 میلیلیتر معرف نینهیدرین و 2 میلیلیتر اسید استیک اضافه گردید. (البته میتوان بدین طریق نیز عصاره تهیه کرد. ابتدا 5/0 گرم از نمونه گیاهی وزن کرده و همراه ازت مایع در هاون چینی کاملا پودر گردید. سپس پودر حاصل را درون لوله آزمایش ریخته و 10 میلیلیتر اسید سولفوسالسیلیک به آن اضافه کرده و 20 دقیقه شیکر نموده و بعد 10 دقیقه با سرعت 2000 دور در دقیقه سانتریفوژ کرده سپس 2 میلی لیتر از عصاره صاف شده برداشته و در یک لوله آزمایش ریخته سپس به هر لوله 2 میلیلیتر معرف نینهیدرین و 2 میلیلیتر اسید استیک اضافه کنیم). لولههای آزمایش در بن ماری با دمای 100 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت قرار داده شدند ، پس از یک ساعت لولهها جهت خاتمه واکنش در داخل حمام یخ گذاشته شدند. مدت زمان خاصی برای این مرحله ذکر نشده و به محض سرد شدن میتوان وارد مرحله بعد شد. پس از سرد شدن لوله ها، به آنها 4 میلیلیتر تولوئن افزوده شد و 30 ثانیه بهم زده شدند و پس از تشکیل دو فاز مجزا قسمت رنگی برداشته شد و توسط اسپکتروفتومتر میزان جذب آنها در طول موج 520 نانومتر قرائت گردید. آنگاه غلظت پرولین بر حسب میکرومول بر گرم ماده تر با استفاده از رابطه زیر محاسبه گردید :
5/115÷تو لو ئن مصرفی× عدد خوانده شده توسط دستگاه
—————————————————————————— = پرولین
5÷ وزن نمونه ( گرم )
برای تهیه استانداردها از مرحله 2 میلی لیتر اسید استیک و 2 میلیلیتر معرف نینهیدرین کار بر روی 2میلیلیتر از هر کدام از غلظتها انجام میشود. برای تهیه Blank، 2 میلیتر اسید سولفوسالسیلیک، 2 میلیلیتر معرف نینهیدرین و 2میلیتر اسید استیک برمیداریم.
این وبلاگ در نظر دارد با توجه به تجربیات بدست آمده در طول سالیان متوالی و مشکلات موجود بر سر راه دانشجویان و محققین عزیز در زمینه اجرای پایان نامه ها با کمترین هزینه و در کمترین زمان ممکن در رفع مشکلات موجود قدم بر دارد.